请选择 进入手机版 | 继续访问电脑版

研究生阶段记录3-PCR介绍

[复制链接]
蝶蝶已蝶已蝶蝶 发表于 2021-1-1 10:33:37 | 显示全部楼层 |阅读模式 打印 上一主题 下一主题
先推荐一个视频,做的动画非常的生动易懂。
https://www.bilibili.com/video/BV1454y1Q7U2
4分32秒开始讲的是PCR扩增,可以看一看。
PCR全称Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应。1985年由DR. Mullis提出,并因此在1993年得到了诺贝尔化学奖。
PCR最简朴的理解就是:一种在体外,可以以指数扩增特定核酸的技能。
PCR反应和细胞内的DNA复制相似,也是一个重复举行DNA模板解链、引物与模板DNA联合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程,这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。
PCR主要包罗三步:
    (1)变性 denaturation
             加热至95℃,维持15-30s,使目标DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA作为反应的模板。
    (2)退火 annealing
             冷却至55℃,引物与DNA模板的互补区域联合,形成模板-引物复合物。
    (3)延伸 elongation
             升温至72℃并维持一段时间,引物在耐热DNA聚合酶的作用下, 以引物为固定起点,以四种单核苷酸(dNTP)作为底物,合成新的DNA链。
以上三步作为一个循环重复举行,每一循环的产物作为下一循环的模板。
PCR反应体系包括:需要扩增的模板、一对寡核苷酸引物、维持pH值的反应缓冲系统、一价或二价阳离子、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶以及PCR促进剂等。
    (1)模板 template
             PCR反应的模板可以使DNA,也可以是RNA。当用RNA作模板时,先颠末反转录生成cDNA然后再举行PCR反应。PCR反应体系中对模板的要求有:DNA模板泉源广泛,但待扩增的模板都需要颠末纯化处置惩罚以撤除DNA聚合酶抑制剂;含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式到场PCR反应体系中;环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA,一般使用线性DNA分子,如果模板为环状质粒,最好先用酶将其切开成线性分子;通常小片断模板DNA扩增效率高于大分子,因此一般在PCR反应前使用呆板剪切大概限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量;选择适宜的模板量。
    (2)引物 primers
             引物是两段与待扩增靶DNA序列侧翼片断互补的寡核苷酸。
    (3)反应缓冲系统 reaction buffer system
             反应缓冲系统提供PCR反应所必须的、符合的酸碱度和某些离子。
    (4)二价阳离子Mg2+ divalent cations
             所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子,通常用Mg2+。PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2+浓度直接相关。反应体系中Mg2+浓度低时,酶的活力显著低落;过高时,酶则催化非特异性扩增。别的Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。
    (5)三磷酸脱氧核苷酸 dNTP
             dNTPs为PCR反应的合成原料。在尺度的PCR反应中各种dNTP的浓度应相等,若任何一种浓度显着差别于其他几种时,会诱发聚合酶的错误掺入而低落链合成的速度。dNTP的浓度直接影响到PCR反应的速度和特异性,因此应严格的控制PCR反应体系中dNTP的浓度。
参考:
1.苏慧慈,刘彦仿.原位PCR[M],科学出书社,p6.
2.王廷华,景强,Pierre Dubus.PCR理论与技能[M],科学出书社.

来源:https://blog.csdn.net/zhangjiali12011/article/details/111397447
免责声明:如果侵犯了您的权益,请联系站长,我们会及时删除侵权内容,谢谢合作!
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则


专注素材教程免费分享
全国免费热线电话

18768367769

周一至周日9:00-23:00

反馈建议

27428564@qq.com 在线QQ咨询

扫描二维码关注我们

Powered by Discuz! X3.4© 2001-2013 Comsenz Inc.( 蜀ICP备2021001884号-1 )